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肿瘤药敏试验的科学发展史

        在中国,癌症发病率与死亡率逐年上升,预计将取代心血管疾病成为全球第一大死亡原因及中国主要的公共健康问题。2016年公布的中国癌症数据报告显示2015年中国恶性肿瘤新发病例为392.9万例,其中发病率为285.83/10万(男性305.47/10万,女性265.21/10万,死亡率为170.05/10万Chen et al., 2016。恶性肿瘤的治疗需要多种治疗策略和因素相互配合。对于不同肿瘤治疗模式,应根据病程、肿瘤大小、转移灶等情况综合判断。精准医疗概念的提出为肿瘤治疗开创了新的时代。

▲ 图片源自Penn Medicine


        精准医疗是指与患者分子化学、细胞生物学、病理生理学特征相匹配的个体化诊断和治疗策略。目前利用基因测序技术寻找患者的基因突变靶点,选择有针对性的化疗或靶向药物对肿瘤细胞精准杀伤成为恶性肿瘤精准治疗的新模式和研究热点。然而由于肿瘤的异质性和细胞基因的不稳定性,仅依靠基因测序技术,在多数情况下不能明确最合理的用药方案。根据2017年Memorial Sloan Kettering Cancer Center的权威数据显示:63%的患者通过基因检测找不到合适的靶向治疗方案(Zehir et al., 2017)。肿瘤的精准医疗不仅包括基因测序,还包括蛋白质组学、个体对药物的应答特征等多层面医疗技术。为了避免肿瘤药物使用的盲目性,提高药物的有效率,利用患者自体原代肿瘤细胞体外进行候选药物或药物组合精确的肿瘤细胞药物敏感性检测,成为一种更直接、更准确的肿瘤诊治模式。

        肿瘤化疗药物敏感性检测,是通过使用患者肿瘤细胞进行体外细胞或体内动物测试,检测临床可用的多种化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,评价不同药物对该患者治疗的有效性,从而增加治疗成功率,避免无效药物的使用,降低治疗风险。自上世纪50年代,经过半个多世纪的发展,肿瘤药敏检测技术总体呈现简单、快速、准确和可靠的发展趋势。而且也逐渐证实肿瘤药敏检测技术对于肿瘤个体化治疗具有重要意义。纵观肿瘤药敏试验技术发展史,肿瘤药敏发展经历发展萌芽阶段、逐渐成熟阶段、临床应用阶段,本文将从这三个阶段阐述肿瘤药敏试验的科学发展历史。


▲ 肿瘤药敏发展史


发展萌芽阶段

        虽然早在1877年就由Pasteur and Joubert在微生物培养的实验中提出了“Chemosentitivity”的概念,到了1928年,Alexander Fleming发现Penicillin才真正开启了药物敏感性试验的新时代,但直到1953年,Black和Speer对肿瘤和非肿瘤样本在体外检测它们对Aminopterin的敏感性(Black and Speer, 1953)才真正开始开启了肿瘤药敏试验的科学发展史,而细胞培养方法和各种检测技术经过近30年的发展,肿瘤药敏试验于1982年首次在欧洲大陆和美国进行大规模的临床研究。

  1. 1953年,Black和Speer率先报道了对肿瘤和非肿瘤标本的体外药敏试验(Black and Speer, 1953),化疗药物敏感性试验从此登上了细胞生物学和肿瘤学的历史舞台。

  2. 1955年Theodore Puck和Philip I Marcus在丹佛COLORADO大学第一次成功克隆了HeLa细胞 (ATCC® CCL-2™)(Puck and Marcus, 1955),在培养过程中他们利用琼脂培养基来纯化癌细胞。

  3. 1969年Rygarrd首次将人体肿瘤组织移植于裸鼠皮下获得成功(Rygaard and Povsen, 2007),移植物包括肿瘤细胞悬液或者组织小块。可以进行皮下移植,也可采用相应脏器包膜移植等方法。这是科学史上的第一次人源性肿瘤动物模型(Patient-derived xenograft, PDX)的建立。

  4. 1971年Dicke等首创肿瘤细胞集落测定法(HTCA)(Dicke et al., 1971),其原理是测定肿瘤细胞中的干细胞,在药物作用下在培养基中形成集落能力的变化。

  5. 1977年 Salmon 和 Hamburger 报道了肿瘤集落形成的新一代技术(Hamburger and Salmon, 1977)。次年Salmon和Hamburger利用体外肿瘤细胞集落形成技术直接测定人肿瘤干细胞对抗癌药物敏感性(Salmon et al., 1978),该方法适用于所有类型恶性肿瘤。但缺点是单个分散的细胞悬液制备较困难;培养的成功率和集落形成率较低;集落生长所需的时间长(约2-3周)费时费力且费用较大。

  6. 1978年Bogden首次创建小鼠肾包膜下移植法(SRCA)(Bogden et al., 1984; Suggitt and Bibby, 2005),原理是肿瘤植入免疫缺陷小鼠肾包膜下。

  7. 1980年,Darzynkiewicz 等开始使用流式细胞技术(FCM)检测细胞周期(Darzynkiewicz et al., 1980)。

  8. 1983年Mosmann利用活细胞分泌物与MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)的显色反应,发展了一种简单、快速检测活细胞生长和繁殖的方法。(Mosmann, 1983)。1986年Gerlier把MTT比色法用于测定细胞活性(Gerlier and Thomasset, 1986),此后,MTT法被应用于各种肿瘤药敏试验。

  9. 1983年Moyer等提出利用生物荧光的方法,测定内源性ATP的含量可以反映细胞活性(Moyer and Henderson, 1983),随后Kangas等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的测定各种细胞活性的检测方法(Kangas et al., 1984)。

  10. 上世纪80年度,随着荧光染料技术的发展,Correa等采用一些特殊的荧光染料(荧光素二乙酸酯,Fluorescein Diacetate)、花青染料(二苯并咪唑,Benzimidazole)对细胞的特定成分进行染色或标记(Correa et al., 1986),或者通过细胞酶使无荧光性的材料分解或转换成荧光材料,通过测定荧光强度换算出活细胞的量。

  11. 1988年,Sevin将ATP-TCA方法用于卵巢癌细胞系以及新鲜肿瘤组织的药敏试验(Sevin et al., 1988),之后在欧洲大陆和美国开展了大量的临床应用研究。


逐渐成熟阶段

  1. 自20世纪80年代开始,美国Lawrence Berkeley National Laboratory(LBNL)的Mina 和 Peterson在对乳腺癌的研究中发明了三维细胞培养技术(Three-dimensional cell culture,TDCC)(Petersen et al., 1992)。3D培养技术是指细胞能够在立体空间内生长、增殖和迁移,构成三维立体的细胞-细胞或细胞-载体复合物,而肿瘤细胞在体外培养过程中以3D状态生长时,细胞内的信号通路的调节更接近于体内肿瘤实体内的状态,肿瘤细胞对药物的反应也比平面培养状态更接近于体内的结果。

  2. 1990年Kern和Weisenthal针对127名患者的临床研究证实体外肿瘤药敏试验可用来预测病人对抗肿瘤药物的耐药性(Kern and Weisenthal, 1990)。

  3. 上世纪80年代末期始,Hoffman等建立了组织培养药物反应试验(Histoculture drug response assay, HDRA),该方法是一种基于微小组织块培养的药物敏感性检测技术,将微小组织培养于一种天然胶原海绵凝胶基质上,同时加入预设的抗癌药物,对其作用一定的时间后,观察组织块对抗癌药物的敏感性。早期该技术的缺点是需要自动放射照相技术测定活细胞活性,之后开始用MTT法测定活细胞(Hoffman et al., 1989; Robbins et al., 1994)。HDRA技术保持了肿瘤组织的微环境,但由于肿瘤组织的异质性,也造成了微小组织块内肿瘤细胞的不均一性。

  4. 1992年,Reynolds BA 等在从鼠纹状体分离神经干细胞并培养的过程中发明了类球体(Spheroid)培养技术(Reynolds and Weiss, 1992)。

  5. 1997年,Kobayyashi等采用胶原作为支架材料的三维立体培养,结合其他体外药敏试验的优点,研发了胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)(Kobayashi et al., 1997),通过组织消化酶消化肿瘤细胞外基质后,回收单纯细胞成分,将细胞包埋于人工细胞外基质内,构成与生物体内相似的肿瘤微环境,进行三维立体培养,然后进行药敏试验。CD-DST法的缺点:需要的仪器设备及试剂比较复杂,费用较高;实验周期较长;要求一定的实验技能。

  6. 从20世纪90年代开始,随着新的细胞培养技术和检测手段的研发,以及不同地域的临床研究的深入开展,越多的证据显示肿瘤体外药敏试验可以预测肿瘤患者对抗癌药物的反应性。至此,肿瘤药敏检测技术已相当成熟,同时各种肿瘤药敏技术也进入了产业化进程。

  7. 1998年,Kurbacher等进行的ATP-TCA药敏检测辅助化疗与传统化疗比较的临床II期试验结果公布:ATP-TCA药敏检测指导的化疗方案治疗复发性卵巢癌与传统化疗方案比较,更能提高临床治疗效果,延长患者总生存期和无进展生存期(Kurbacher et al., 1998)。

  8. 1998年,德国DCS公司将ATP-TCA检测技术产业化,并获得国际ISO质量评估体系认证,在欧洲和北美市场获得准入。此外,美国National Institutes of Health(NIH)的GOG(Gynecologic Oncology Group)项目组认为ATP-TCA是最有发展前途的药敏试验方法,并将其纳入重点科研项目。

  9. 2001年,美国全国医疗保险协会(Health Maintenance Organziation)认为ATP-TCA技术是一项精确、可靠、能指导医生选择用药的先进技术,建议在全美进行医疗保险赔付。目前在加州等6个州已获医疗保险赔付。

  10. 2003年日本厚生省和保险联合会认为ATP-TCA是一项先进的临床医学项目,建议该项技术在全国范围内获得医疗保险赔付,次年获准加入医疗保险。目前此项技术现已在5家国家级研究所获医疗保险赔付。

  11. 2005年ATP-TCA检测技术相关试剂盒首次得到国家SFDA 的生产和注册许可,用于临床。

  12. 2008年,CD-DST药敏检测项目纳入日本社会保险医疗协会。

  13. 2009年荷兰Clevers团队将小鼠肠段中分离出的隐窝细胞培养在含有EGF、Noggin和R-Spondin的三维Matrigel中,形成类似于肠道的微型结构,即隐窝-绒毛复合体(Barker et al., 2010)。自此成功培养出3D肠组织类器官(Organoid)模型以来,多种“迷你器官”得以建立。Organoid技术被Science杂志评选为2013年科技发展的十大突破之一以及2017年生命科学领域的年度技术(Method of the Year 2017)。


临床应用阶段

        随着肿瘤细胞活性检测技术的逐渐成熟,以及各种新型原代细胞培养技术在世界范围内被广泛认同和应用,肿瘤化疗药物敏感性检测在国内外广泛应用于临床诊疗工作中。目前,国内多家第三方医疗检测机构和各级医院的肿瘤相关专业都在逐渐开展肿瘤化疗药物敏感性检测,帮助临床医生和癌症患者找到最佳的用药方案。

  1. 2008年,北京交通大学附属第六人民医院药剂科开展的改进型MTT法化疗药物敏感性检测。

  2. 2011年,HDRA药敏检测纳入河南省医疗服务项目。

  3. 2013年,重庆市颁布的《重庆市基本医疗保险和生育保险诊疗项目暨医疗服务设施标准》将人体肿瘤SKC法药敏测定纳入医保范围。

  4. 2014年,河津大学附属肿瘤医院开展了适用于个体化疗的体内和体外药物敏感性试验。

  5. 2016年,新疆自治区医疗服务项目提及SKC肿瘤测定。

  6. 2016年,河南省郑州市鼓楼医院开展利用新鲜原代肿瘤组织进行三维立体培养的药敏检测平台(HDRA)指导化疗药物的选择。

  7. 前年,湖北大学医学院附属邵逸夫医院、附属第二医院开展基于体外3D培养的肿瘤药敏检测。

  8. 前年10月,北京长征医院肿瘤药敏检测服务公布中标结果。

  9. 去年3月,襄阳医科大学附属第一医院肿瘤药敏检测服务公布中标结果。

        到目前为止,中国包括重庆市肿瘤医院、山东省人民医院、中国医学科学院肿瘤医院、甘肃省肿瘤医院、太原医科大学附属肿瘤医院、江苏省肿瘤医院、湖北大学医学院附属第二医院及附属邵逸夫医院、襄阳医科大学附属第一医院、北京长征医院在内共有40家左右在开展肿瘤药敏检测。

▲ 图片源自Financial Times


        目前,对于恶性肿瘤的精准治疗在肿瘤治疗中占据首位。无论是肿瘤相关基因检测,还是蛋白质组学、功能组学、肿瘤药敏检测等其他医学、细胞生物学前言技术,在考虑肿瘤患者的个体差异基础上,精准的找到治疗靶点以及个体对各种抗癌药物的应答反应,最终制定个体化治疗方案。恶性肿瘤精准治疗的目标是延长患者的生存期、提高患者的生活质量,最终实现恶性肿瘤的慢病管理。随着精准医疗要求的不断提高,临床对肿瘤细胞化疗药物敏感检测的需求和要求也会随之提高。相比于国内现行技术,体外3D细胞药敏检测技术不仅在原代细胞培养和结果检测方面做了较大优化和创新,而且准确度也得到了大幅提升,该技术的应用将会大大提高临床诊疗水平。

        针对肿瘤临床化疗的痛点,科医诊断率先建立了国际领先的体外3D细胞药敏检测平台和体内药敏(PDX/FAST-PDX)检测平台,开展肿瘤药敏检测技术服务,科学评估该患者对不同药物的敏感性,精确预见其治疗效果,给患者筛选出相对有效的药物,为临床医生制定个体化的精准化疗方案提供科学依据,提高治疗受益率,造福癌症患者。


延伸阅读:

肿瘤化疗药物敏感性检测为癌症患者提供个体化治疗(附每种癌症的常用化疗方案)


参考文献

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2019/7/25 16:11:00

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